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培养基的配制与灭菌方法说明

2018-08-30 09:23:16  来源:内容来源于网络 浏览量:847次
【导读】培养基(Medium)是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有水、氮源、无机盐(包括微量元素)、碳源、生长因子(维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激...

培养基(Medium)是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有水、氮源、无机盐(包括微量元素)、碳源、生长因子(维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激素和血清等)等。
不同培养基可根据实际需要,添加一些自身无法合成的化合物,即生长因子。有些微生物,如自养型微生物,不需要碳源,所以上述物质只具有一般性。培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管,均改制成粉末。
培养基的配制
1.配料
配方换算→在容器中加入少量水(蒸馏水,自然水)→按照配方称取各种药品(依次加入)→加足所需水量(一药一勺,取药后立即盖上瓶盖)。
2.溶解
淀粉溶解:少量冷水调成糊状加热溶解,特别是加有琼脂的培养基,一定要煮沸,琼脂的熔解温度95-97℃,且需要边加热边搅拌以防止烧焦。
3.调PH
用1N的盐酸或1N的NaOH把培养基调节到所要求的值。
4.过滤
滤纸或棉花进行过滤。(有时可以省去)
5.分装
一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。
(1)三角瓶
若作静置培养,则100ml培养基/250ml的三角瓶,最多不能超过150ml培养基/250ml的三角瓶,否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞,造成染菌;若作摇瓶培养,则15-20ml培养基/250ml的三角瓶,保证通气良好。
(2)试管分装
液体培养基一般装4-5ml,约试管的1/4高度;固体斜面培养基一般装3-4ml,约试管的1/5高度。
6.包扎
分装好后,塞上棉塞,在用牛皮纸将棉塞包裹好,防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。
7.灭菌
按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高,营养成分会被破坏,培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。
8.摆斜面
灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放,使其凝固成为一个斜面,约占试管长度的1/2。
9.贮存
培养基在30℃下放置一天,无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用。
培养基的灭菌
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低。在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固;同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力。
湿热灭菌有煮沸消毒法和高压蒸汽灭菌法两种,煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好,然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15~30min,对于芽孢则需煮沸约1~2h。
高压蒸汽灭菌法是高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15~30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
培养基注意事项
1、确认工作细胞库是否被污染,确认毒种工作种子批是否被污染,确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染,均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中,可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养,48小时即可观察有无污染。
2、其它:高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证,确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证,后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。
3、另外,应将有毒区与无毒区严格分开,并有各自独立的空气净化系统及孵室,有毒区对无毒区应保持相对负压,防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。


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